• 影響因素

從酶活定義中我們可以看出，影響酶活性實驗的主要因素有溫度、pH、時間。

學過酶工程的小伙伴應該很清楚，酶活性實驗的本質(zhì)還是酶促反應嘛，所有影響酶促反應的因素都同樣影響酶活性實驗。

1、溫度：一般來說，在一定溫度范圍內(nèi)，酶促反應速度隨溫度的增高而加快，但當溫度增加達到某一點后，由于酶蛋白的熱變性作用，反應速度迅速下降。酶促反應速度隨溫度升高而達到一最大值時的溫度就稱為酶的最適溫度。

所以，我們在做酶活性實驗的時候，一定要嚴格的控制反應溫度，保證同一批樣品都在相同的溫度下進行，可以選擇水浴或金屬浴保溫。溫度最好選擇在最適溫度，如果無法判斷最適溫度，那就遵循哺乳動物樣本37℃，其他樣本25℃的原則。當然，對于一些反應時間很短的酶活實驗，很難嚴格控溫，可以在室溫下反應（室溫在20-40℃），保證一批樣品測定過程中室溫穩(wěn)定一致。

2、pH：pH對酶促反應速度的影響，通常為一鐘形曲線，即pH過高或過低均可導致酶催化活性的下降。酶催化活性最高時溶液的pH值就稱為酶的最適pH。

酶活檢測實驗中通常會選擇在最適pH下進行，pH由緩沖液或底物提供，如pH6.8的PBS緩沖液、pH7.4的生理鹽水、pH5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液等。一般參考指導書或試劑盒說明書即可。如果無法確定最適pH，那就用7.0-7.4吧，適合大部分酶。

3、時間：時間對酶促反應的影響主要體現(xiàn)在反應速率的變化和反應階段的劃分上。酶促反應過程中，時間會影響反應的速率和進程，主要分為延滯期、線性期和非線性期三個階段。在延滯期，酶與底物結合需要一定的時間，反應速率較慢。在線性期，酶促反應速度達到并保持恒定速率進行反應。此時，反應速率不受底物濃度的影響，酶活性與反應速率成正比，是酶活性測定的最佳時期。這段時間一般為1到5分鐘（可能更長）。隨著反應時間的延長，底物消耗越來越明顯，反應速率逐漸下降，進入非線性期。

線性期是酶活性測定的最佳時期。如葉片的POD酶活性檢測，通常選擇30s-2min30s作為最佳測定時間。不同酶的線性期也不同，一般參考指導書或試劑盒說明書。

4、酶液濃度和酶液用量：在底物濃度足夠大，足以使酶飽和的情況下，酶促反應的速度與酶濃度成正比。

酶活檢測實驗中，如果遇到OD值變化很小的情況，可以適當增加酶液用量（體積）或增大酶液濃度（重新提取酶液，減少提取液用量）。‌

在酶活檢測實驗中，除了上述4個影響因素外，還有底物濃度、金屬離子等也能影響酶促反應。這些在指導書或試劑盒中已經(jīng)準備好了，不做過多說明。

值得注意的是：同一批樣品一定要保證所用試劑的pH、底物濃度、金屬離子等一致，如果一批樣品檢測要用多個同貨號的試劑盒，要將相同組分提前混勻，以消除試劑盒配置的批次誤差。如果是自配試劑也一樣操作。