腫瘤類器官作為重要的體外細(xì)胞模型為腫瘤藥物研究提供了新的工具，相比于傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系，3D培養(yǎng)的類器官可以更好地維持癌癥患者的腫瘤特征，反映腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性。因此，基于類器官模型的藥物篩選不僅可以發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療藥物，還可以用于探究不同突變類型細(xì)胞的藥物敏感性差異。盡管基于腫瘤類器官的藥物篩選助力了靶向藥物研究，但是目前藥物篩選的評價標(biāo)準(zhǔn)主要是基于增殖和凋亡等細(xì)胞表型特征，對藥物的作用機(jī)制少有分子層面的深入解析。

　　2023年6月22日，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心(BIOPIC)湯富酬團(tuán)隊(duì)與北京大學(xué)第三醫(yī)院普通外科付衛(wèi)團(tuán)隊(duì)合作在Protein & Cell上發(fā)表了文章Drug repurposing screening and mechanism analysis based on human colorectal cancer organoids，成功建立了基于人類結(jié)直腸癌類器官模型的體外藥物篩選和藥效評價平臺，采用“老藥新用”的策略，使用小分子藥物體外篩選手段并經(jīng)過免疫缺陷小鼠體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到多種具有潛在結(jié)直腸癌治療價值的候選藥物，并在轉(zhuǎn)錄組水平對候選藥物的作用機(jī)制進(jìn)行深入解析。

　　該研究的主要發(fā)現(xiàn)有：

　　1.結(jié)合藥物預(yù)測方法進(jìn)行基于結(jié)直腸癌類器官的藥物篩選，在335種FDA批準(zhǔn)的治療其他疾病的臨床藥物中，篩選得到34種潛在靶向結(jié)直腸癌的候選藥物。

　　該研究首先利用轉(zhuǎn)錄組、外顯子組和DNA甲基化組測序技術(shù)，在多組學(xué)水平上對結(jié)直腸癌類器官的分子特征進(jìn)行解析、對腫瘤類器官與患者原位腫瘤的一致性進(jìn)行評估。通過對比發(fā)現(xiàn)，該研究構(gòu)建的結(jié)直腸癌類器官可以很好地保留原位腫瘤組織的突變特征、重要信號通路的表達(dá)水平以及基因啟動子區(qū)域的甲基化水平。值得一提的是，該研究構(gòu)建的8個結(jié)直腸癌類器官中有3個攜帶有KRAS突變，KRAS突變是結(jié)直腸癌中最常見的突變之一，突變頻率約為30%-50%。該研究中的結(jié)直腸癌類器官同時囊括了帶有KRAS突變和不含KRAS突變的腫瘤類型，具有很好的代表性，能夠更好地體現(xiàn)各種亞型結(jié)直腸癌的腫瘤特征。

　　為了能夠篩選到毒副作用小且具有潛在的殺傷結(jié)直腸癌細(xì)胞的藥物，除了使用經(jīng)過FDA批準(zhǔn)的治療其他疾病的藥物庫外，該研究利用已有數(shù)據(jù)庫進(jìn)行條件嚴(yán)格的藥物預(yù)測，并且使用結(jié)直腸癌臨床常用藥5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)和瑞戈非尼(Regorafenib)作為陽性對照。篩選結(jié)果顯示，在包含預(yù)測藥物的共335種藥物中，34種藥物具有潛在殺傷結(jié)直腸癌類器官的能力。

　　為了進(jìn)一步確認(rèn)篩選到的34種藥物對不同患者來源的結(jié)直腸癌類器官的殺傷效果，該研究在8個結(jié)直腸癌類器官系中對藥物效果進(jìn)行測試。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同患者來源的類器官對34種候選藥物的敏感性不同，臨床上常用的5-氟尿嘧啶和瑞戈非尼兩種結(jié)直腸癌治療藥物也顯示出對不同的類器官系的敏感性不同，說明不同患者之間的藥物響應(yīng)差別大，這說明使用類器官篩選藥物進(jìn)而幫助指導(dǎo)患者用藥的重要性。

　　2.依據(jù)轉(zhuǎn)錄組特征將結(jié)直腸癌類器官對有效的34種候選藥物的響應(yīng)分為五種模式：促分化類、抑生長類、抑代謝類、促免疫響應(yīng)類和抑細(xì)胞周期類。

　　為了進(jìn)一步探究篩選得到的34種候選藥物的作用機(jī)制，該研究分別對不同患者來源的腫瘤類器官進(jìn)行藥物處理，收集藥物處理后的類器官樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，在腫瘤相關(guān)信號通路的干擾、結(jié)直腸癌腫瘤特征基因表達(dá)、腫瘤耐藥相關(guān)基因表達(dá)以及細(xì)胞分化干性四個方面對34種藥物的作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的揭示。

　　首先，該研究通過基因集富集分析探究藥物處理后類器官的細(xì)胞增殖、免疫激活、應(yīng)激及代謝等腫瘤相關(guān)通路的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管篩選出的藥物都可以抑制腫瘤類器官的細(xì)胞活力，但從轉(zhuǎn)錄組水平上看，不同藥物干擾的細(xì)胞信號通路不同，說明不同藥物的作用方式不同，主要區(qū)分為5個類群，結(jié)合腸道上皮細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)水平高低，該研究將5個類群進(jìn)一步定義為：促分化類、抑生長類、抑代謝類、促免疫響應(yīng)類和抑細(xì)胞周期類。

　　類群1為促分化類，該類群的特征為不同腸道細(xì)胞類型的標(biāo)志基因的表達(dá)相對其他類群較高，說明腫瘤類器官的分化特征增強(qiáng)。提示類群1的藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也可能通過促進(jìn)細(xì)胞分化進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。通過基因功能富集分析，發(fā)現(xiàn)該類群藥物明顯抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，并且抑制Wnt信號通路的表達(dá)。同時，與腸道吸收和分泌功能相關(guān)的基因CHGB、S100A9、SLC17A7和SLC8A2的表達(dá)上調(diào)。類群2為抑生長類，轉(zhuǎn)錄組特征為應(yīng)激相關(guān)通路和代謝相關(guān)通路的干擾相對其他類群較弱，通過基因功能富集分析，發(fā)現(xiàn)該類群明顯抑制生長因子響應(yīng)通路以及MAPK信號通路。類群3為抑代謝類，轉(zhuǎn)錄組特征為與代謝相關(guān)通路如糖酵解通路的表達(dá)被抑制。該類群下調(diào)的基因富集在碳水化合物代謝和氨基酸代謝等功能中。類群4為促免疫響應(yīng)類，其轉(zhuǎn)錄組特征主要表現(xiàn)為免疫響應(yīng)和應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)通路的激活。通過基因功能富集分析，發(fā)現(xiàn)該類群的特異性高表達(dá)基因富集在嗜中性粒細(xì)胞脫顆粒、MHC-I類分子的組裝和呈遞等功能。說明該類群的藥物不僅殺傷腫瘤細(xì)胞，同時也可能通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抗原遞呈的效果，釋放招募免疫細(xì)胞的信號，促進(jìn)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。類群5的細(xì)胞周期等相關(guān)信號通路的表達(dá)受到抑制的程度最強(qiáng)，被定義為抑細(xì)胞周期類。其轉(zhuǎn)錄組特征表現(xiàn)為有絲分裂紡錘體功能被抑制、鐵死亡通路激活，且腸道細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)。該類群的差異低表達(dá)基因富集在細(xì)胞有絲分裂、DNA復(fù)制和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)等功能上。同時，與細(xì)胞周期和DNA復(fù)制功能相關(guān)的基因CDK1、CDKN3、CENPE和TOP2A的表達(dá)下調(diào)。

　　值得一提的是，該研究鑒定得到的抑生長類，抑代謝類和抑細(xì)胞周期類藥物的相關(guān)功能被之前的腫瘤藥物篩選研究認(rèn)為是殺傷腫瘤細(xì)胞的藥物的常見功能，而促分化類和促免疫響應(yīng)類的藥物除了會對腫瘤細(xì)胞直接產(chǎn)生殺傷作用之外，還會對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生其他特征的影響。促分化類藥物還可能使腫瘤細(xì)胞朝著更加分化的狀態(tài)轉(zhuǎn)化，從而使腫瘤細(xì)胞更容易被殺傷。促免疫響應(yīng)類藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時還可能會使腫瘤細(xì)胞的抗原呈遞功能增強(qiáng)，從而更容易招募T細(xì)胞、髓系細(xì)胞等免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。促分化類和促免疫響應(yīng)類的藥物具有進(jìn)一步研究和應(yīng)用的潛在價值，相關(guān)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)需要進(jìn)一步開展以證明其對腫瘤細(xì)胞的多方面影響。

　　根據(jù)結(jié)直腸癌類器官在藥物處理之后的轉(zhuǎn)錄組特征，該研究將腫瘤類器官對藥物的響應(yīng)分為5種模式，分別為：促分化類、抑生長類、抑代謝類、促免疫響應(yīng)類和抑細(xì)胞周期類。每個類群中的藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的方式各不相同，不同類群藥物作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制各有差別。

　　3.免疫缺陷小鼠體內(nèi)移植成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，曲美替尼(Trametinib)、硼替佐米(Bortezomib)和菲卓替尼(Fedratinib)三種藥物具有治療結(jié)直腸癌的潛在價值。

　　為了進(jìn)一步探究候選藥物在體內(nèi)環(huán)境中的表現(xiàn)情況，該研究構(gòu)建了基于類器官的小鼠異種移植模型(patient derived organoid-based xenografts, PDOX)。結(jié)合藥物殺傷效果和其在臨床使用中的毒性情況，該研究在每個藥物響應(yīng)類群中各選取了1到2種細(xì)胞殺傷效果強(qiáng)、臨床使用毒性小的藥物(共7個)在PDOX模型上進(jìn)行體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)。通過統(tǒng)計(jì)處理后小鼠腫瘤的重量變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過8種藥物處理后，小鼠的腫瘤質(zhì)量的中位數(shù)都降低，說明與體外的篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，篩選得到的藥物都有潛在抑制結(jié)直腸癌腫瘤的效果。其中，除臨床常用藥物5氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)之外，曲美替尼(Trametinib)、硼替佐米(Bortezomib)和菲卓替尼(Fedratinib)的抑制腫瘤的效果明顯。

　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證體內(nèi)環(huán)境中藥物的作用效果，該研究解剖腫瘤塊進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使腫瘤明顯縮小的藥物，腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期等與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號通路表達(dá)受到明顯抑制，進(jìn)一步驗(yàn)證了曲美替尼、硼替佐米和菲卓替尼可能為治療結(jié)直腸癌的潛在藥物。

　　綜上，該研究建立了基于人類腫瘤類器官、并且結(jié)合實(shí)驗(yàn)篩選和計(jì)算預(yù)測的藥物篩選方法，成功篩選驗(yàn)證得到治療結(jié)直腸癌的潛在候選藥物。同時利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)揭示了候選藥物的作用機(jī)制和作用模式，為結(jié)直腸癌治療藥物的發(fā)現(xiàn)提供了重要的數(shù)據(jù)支持，該研究對結(jié)直腸癌的臨床治療具有潛在應(yīng)用價值。

　　北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心、北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院毛雨諾博士(現(xiàn)山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院助理研究員)、博士生王維、楊經(jīng)緯博士為該論文的并列第一作者。北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心湯富酬教授與北醫(yī)三院普通外科付衛(wèi)教授為該論文的共同通訊作者。

　　原文鏈接：

　　https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwad038/7204964

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