作為一種惡性程度非常高的腫瘤，肝癌在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率都位居前列。我國國家癌癥中心最新數(shù)據(jù)顯示，肝癌導(dǎo)致的死亡排名第二位，是我國人民極大的健康負(fù)擔(dān)。其中，肝細(xì)胞癌(HCC)是肝癌的主要亞型，占據(jù)原發(fā)性肝癌的75%-85%。針對HCC治療策略的開發(fā)和改進(jìn)一直是迫切的臨床需求。

　　眾所周知，針對PD-1和CTLA-4的免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICB)已被廣泛用于癌癥治療，對多種晚期癌癥有療效。ICB單藥的臨床數(shù)據(jù)顯示，納武利尤單抗和帕博利珠單抗分別在晚期HCC患者治療中達(dá)到15%和18.3%的客觀緩解率(ORR)。但同時(shí)，ICB在約20%的患者中引起了3級或以上的免疫相關(guān)不良事件(irAE)。

　　聯(lián)合免疫療法雖然提高了HCC患者的ORR，但irAEs發(fā)生率也隨之增加。例如，抗PD-1聯(lián)合抗CTLA-4的ORR為31%，3/4級irAEs的發(fā)生率為37%;抗PD-L1聯(lián)合抗血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A)的ORR為27.3%，3/4級irAEs的發(fā)生率為56.5%。因此，要改善HCC患者的免疫治療結(jié)果，就必須先消除ICB的副作用。

　　近日，由新加坡國立癌癥中心的David Tai和新加坡國立大學(xué)的Valerie Chew領(lǐng)銜的團(tuán)隊(duì)，在Journal of Hepatology期刊發(fā)表重要研究成果 。

　　通過深度單細(xì)胞免疫分析，他們發(fā)現(xiàn)HCC患者的血液樣本中不同的抗原遞呈細(xì)胞(APC)和效應(yīng)記憶T細(xì)胞(TEM)亞型，可作為區(qū)分ICB應(yīng)答和副作用的生物標(biāo)志物。而通過控制僅影響ICB副作用產(chǎn)生的免疫通路，他們在小鼠模型中證實(shí)，TNFR2抑制可以在保證ICB治療效果的同時(shí)消除免疫治療的副作用。

　　研究人員首先收集了在新加坡接受抗PD-1治療的HCC患者(以下簡稱SG組)治療前和治療中的血液樣本，通過質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)(CyTOF)和單細(xì)胞測序研究了ICB應(yīng)答和irAEs的發(fā)生機(jī)制以及生物標(biāo)志物。接下來他們進(jìn)行了多輪驗(yàn)證，包括收集來自韓國的HCC患者樣本(以下簡稱KR組)作為獨(dú)立驗(yàn)證組，用流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證他們從SG組分析中發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物，對SG組治療前和治療后1周的腫瘤活檢樣本進(jìn)行批量測序分析，最后使用小鼠HCC模型進(jìn)行治療驗(yàn)證。

　　研究者們對所有患者(SG+KR)進(jìn)行了兩種分組。根據(jù)ICB治療結(jié)果，患者被分為有反應(yīng)者(Res，即部分緩解[PR]或疾病穩(wěn)定[SD]≥6個(gè)月的患者)和無反應(yīng)者(Non-Res，即6個(gè)月內(nèi)有疾病進(jìn)展的患者)。6個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)是根據(jù)Checkmate040研究判定，其結(jié)果顯示接受納武利尤單抗治療的HCC患者中，SD≥6個(gè)月的患者占比37%。

　　根據(jù)是否有過irAEs副作用發(fā)生，患者被分為不良反應(yīng)組(Tox，即經(jīng)歷過2級[G2]或以上irAE的患者)，和無不良反應(yīng)組(non-Tox，即經(jīng)歷過G1或無irAE)。值得注意的是，G2 irAE是考慮干預(yù)或中斷ICB的指標(biāo)。為了找到可以在治療早期預(yù)測ICB應(yīng)答或篩查irAEs高風(fēng)險(xiǎn)患者的生物標(biāo)志物，研究者們選取了SG組中治療前和治療早期(<6周)的樣本(n=21)。

　　通過分析6個(gè)Res與六個(gè)Non-Res樣本的CyTOF結(jié)果，研究者們發(fā)現(xiàn)了三個(gè)在Res組中富集的T細(xì)胞簇：FoxP3+CD4+T細(xì)胞(C33)，F(xiàn)oxP3+CTLA4+CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)(C3)，以及CD8+CD45RO+CCR7-CXCR3+TEM(C76)。此外，他們還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)不同的CD11c+髓細(xì)胞簇，在Res組富含的HLADRhiCD86+APC簇(C4)，和在Non-Res組富含的CD14+HLADRlo/-，疑似髓源性抑制細(xì)胞簇(MDSCs)(C37)。

　　ICB Res和Non-Res患者的血液中有不同免疫細(xì)胞亞型

　　接下來，研究者們用流式細(xì)胞術(shù)對SG和KR組樣本進(jìn)行了驗(yàn)證，對ICB有較好反應(yīng)的Res組患者血液中普遍有更多Treg，APC，和CXCR3+CD8+TEM細(xì)胞。此外，多變量分析顯示，這些生物標(biāo)志物與Res組更好的無進(jìn)展生存期(PFS)顯著相關(guān)。其中CXCR3+CD8+TEM和APC的富集是PFS的獨(dú)立預(yù)測因子。更重要的是，irAEs分組后的分析顯示，CXCR3+CD8+TEM和APC仍然在SG和KR兩組的Res患者中顯著富集，尤其是在Non-Tox患者中。這些數(shù)據(jù)表明，外周血CXCR3+CD8+TEM和APC是HCC ICB治療預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。

　　接下來，研究者們分析了在Tox患者irAEs發(fā)生期間或±兩周內(nèi)采集的血液樣本，并與在相同時(shí)間點(diǎn)采集的Non-Tox患者樣本進(jìn)行了對比。結(jié)果顯示，Tox組的血樣中富含兩個(gè)CXCR3+CD38+CD16+CD56+NK細(xì)胞簇(C89，C99)，而Non-Tox患者血樣則富含三個(gè)CD8+T細(xì)胞簇，兩種TEM(CD45RO+CCR7-;C66，C76)和粘膜相關(guān)不變T(MAIT)細(xì)胞(V?7.2+CD161+CD56+CD8+，C96)，以及一個(gè)髓細(xì)胞簇(CD11c+CD14+HLADR+，C27)。流式細(xì)胞術(shù)的驗(yàn)證結(jié)果也顯示出相同的趨勢。

　　有趣的是，前文所提到的在Res組中發(fā)現(xiàn)的CXCR3+CD8+TEM(C76)同樣在Non-Tox組中富集。在不考慮ICB應(yīng)答的情況下，以上五種免疫亞群(NK，CD8 T，TEM，MAIT，APC)代表了與irAEs相關(guān)的生物標(biāo)志物。

　　與ICB副作用相關(guān)的外周血免疫細(xì)胞

　　為了更深入地了解上述免疫亞群，研究者們對10個(gè)外周血樣本進(jìn)行了單細(xì)胞測序，其中包括9個(gè)治療中期樣本(6個(gè)Res和3個(gè)Non-Res;5個(gè)Tox和4個(gè)Non-Tox)和一個(gè)治療前樣本(Res/Tox)。利用差異基因表達(dá)分析(DEG)，他們從59980個(gè)單細(xì)胞中識(shí)別出了29個(gè)簇。其中，Treg(CD3D+CD4+FOXP3+CTLA4+IL2RA+)簇，和表達(dá)ITGAX(CD11c)，HLA-DPA1，THBD(CD141)和CLEC9A的常規(guī)I型樹突狀細(xì)胞(cDC1)APC簇，在Res中顯著富集。兩個(gè)表達(dá)CD14和ITGAX(CD11c)的髓細(xì)胞簇，CD14-1和CD14-3，則與Non-Tox相關(guān)。研究者們還發(fā)現(xiàn)，這些CD14+簇高表達(dá)KLF4和CLEC7A，這是巨噬細(xì)胞向免疫抑制性極化的標(biāo)志。

　　為了破譯ICB應(yīng)答和irAE這兩個(gè)不同臨床指標(biāo)背后的免疫機(jī)制，研究者們將目光轉(zhuǎn)向了與這兩種事件都相關(guān)的CD11c+APC。Res患者富集的cDC1簇表達(dá)了高水平的HLA相關(guān)基因，表明這些細(xì)胞具有優(yōu)秀的的抗原呈遞能力。CD11c+APC的基因集富集分析(GSEA)也驗(yàn)證了這些細(xì)胞的功能性，這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組富集了包括抗原加工和MHC II類呈遞，T細(xì)胞共刺激，干擾素-γ信號(hào)傳導(dǎo)等重要的免疫啟動(dòng)相關(guān)基因集。與Non-Tox相關(guān)的其他兩個(gè)髓細(xì)胞簇(CD14-1和CD14-3)的對比顯示，CD14-1比CD14-3表達(dá)了更高水平的抗原呈遞HLA相關(guān)基因，而CD14-3則表達(dá)了更高水平的免疫抑制性細(xì)胞受體STAB1(Clever-1)GSEA分析也顯示，相對于CD14-1，與Non-Tox更顯著相關(guān)的CD14-3減少了抗原呈遞和炎癥特征的基因集，因此更具備免疫抑制性表型。

　　研究者們也對前文中與ICB應(yīng)答和irAEs相關(guān)的重要CD8+T細(xì)胞簇(CXCR3+TEM)進(jìn)行了單細(xì)胞測序分析。他們發(fā)現(xiàn)，與所有其他T細(xì)胞相比，CXCR3+TEM上調(diào)了包括抗原呈遞，HLA(s)，炎癥，顆粒酶，和細(xì)胞增殖的多個(gè)基因，例如MKI67。相反，CCR7，IL7R和LEF1等幼稚T細(xì)胞基因在CXCR3+TEM中表達(dá)下調(diào)，表明這些T細(xì)胞有效應(yīng)記憶表型。GSEA分析也不出所料的呈現(xiàn)出包括炎癥反應(yīng)，細(xì)胞溶解，抗原加工以及通過MHC II類呈遞等基因集在CXCR3+TEM中富集。

　　這些結(jié)果都顯示，與其他T細(xì)胞相比，CXCR3+CD8+TEM呈現(xiàn)出強(qiáng)炎癥和細(xì)胞溶解力表型。

　　鑒于全身免疫是一個(gè)動(dòng)態(tài)的系統(tǒng)，各種細(xì)胞串?dāng)_都可能影響整個(gè)大環(huán)境的免疫功能，研究者們還使用CellPhoneDB[11]對CXCR3+CD8+TEM轉(zhuǎn)錄組中受體和配體的表達(dá)進(jìn)行了識(shí)別，以預(yù)測它們與其他免疫細(xì)胞的通訊。

　　他們發(fā)現(xiàn)，可促進(jìn)炎癥和腫瘤發(fā)生的三種受體，淋巴毒素α(LTA)受體，腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF1A，1B)，和淋巴毒素β受體(LTBR)[12]均在Res和Tox組的CXCR3+CD8+TEM細(xì)胞樣本中富集。也就是說，這些細(xì)胞擅長與其他細(xì)胞形成促炎相互作用，從而導(dǎo)致ICB應(yīng)答和irAEs。

　　此外，研究者們還觀察到CXCR3+CD8+TEM和髓細(xì)胞群之間存在明顯的TNF相互作用。Res患者的TEM和APC之間主要進(jìn)行的是TNF-TNFRSF1B(TNFR2)信號(hào)傳導(dǎo)，Non-Tox患者則是TNF-TNFRSF1A(TNFR1)信號(hào)傳導(dǎo)。TNF與TNFR1和TNFR2的相互作用在巨噬細(xì)胞活化和炎癥中有著重要角色。

　　研究者們用流式細(xì)胞術(shù)測定了TNF?，TNFR1，和TNFR2的蛋白質(zhì)表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)，Res組的CXCR3+CD8+TEM細(xì)胞比Non-Res組表達(dá)了更高的TNF?。

　　在髓細(xì)胞的對比中，Non-Tox組的CD14+單核細(xì)胞和CD14-CD11c+HLA-DR+樹突狀細(xì)胞(DC)比Tox組增加了TNFR1表達(dá)。而對比Res和Non-Res組時(shí)，研究者們發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞和DC上的TNFR2表達(dá)沒有顯著差異。

　　也就是說，ICB應(yīng)答(Res)中TNF信號(hào)作用的增加主要是由TNF?上調(diào)驅(qū)動(dòng)的，而在沒有irAEs(Non-Tox)的患者中，主要是由于TNFR1表達(dá)增加。這表明，我們可以利用不同的TNF信號(hào)通路來解耦I(lǐng)CB應(yīng)答和irAEs的產(chǎn)生，在保留治療效果的同時(shí)抑制副作用的發(fā)生。

　　為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，研究者們用小鼠模型進(jìn)行了抗PD-1和/或抗TNFR1或抗TNFR2的治療試驗(yàn)。

　　經(jīng)過四輪治療，腫瘤結(jié)節(jié)在所有聯(lián)合治療組的小鼠中都顯著減少，而接受抗PD-1+抗TNFR2聯(lián)合治療的小鼠腫瘤負(fù)荷為零。

　　研究者們還觀察到，抗PD-1+抗TNFR1治療組小鼠的肝臟/體重比顯著增高，而小鼠沒有體重或腫瘤負(fù)荷上的明顯變化，這側(cè)面說明了這組小鼠表現(xiàn)出了肝臟肥大和炎性副作用。這項(xiàng)結(jié)果也證實(shí)了研究者們之前在Non-Tox患者中觀察到的TNFR1增加有防止irAEs的保護(hù)作用。令人驚喜的是，抗PD-1+抗TNFR2治療組的小鼠副作用水平和對照組一致，并成功清除了腫瘤，這些結(jié)果給研究者們的假設(shè)提供了有力的支持。

　　研究者們認(rèn)為，TNFR2抑制之所以能在保護(hù)ICB作用的情況下降低副作用炎性反應(yīng)，是因?yàn)門NFR2優(yōu)先表達(dá)于高免疫抑制型Treg細(xì)胞上。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，研究者們從患者外周血，非腫瘤肝臟，和HCC樣本中分選了Treg和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)進(jìn)行對比。他們發(fā)現(xiàn)，與TIL中的其他細(xì)胞相比，Treg的TNFRSF1B(TNFR2)表達(dá)顯著高于TNFRSF1A(TNFR1)。與來自外周血的或非腫瘤肝臟組織的Treg相比，TIL-Treg的TNFRSF1B表達(dá)也顯著增高。這些發(fā)現(xiàn)證明，TNFR2特異表達(dá)于HCC TIL中的Treg細(xì)胞，抑制后可以增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)，并不會(huì)增強(qiáng)全身副作用。

　　此外，研究者們還在所有抗PD-1治療組(單藥或聯(lián)合治療)的小鼠腫瘤中觀察到了CXCR3+CD8+T細(xì)胞和CD11c+MHCII+XCR1+cDC1細(xì)胞數(shù)量的增加。前文提到，這些免疫亞型是HCC患者外周血中與ICB應(yīng)答相關(guān)的生物標(biāo)志物，相似的免疫亞型或是小鼠腫瘤浸潤中起到關(guān)鍵抗癌作用的細(xì)胞。

　　小鼠腫瘤浸潤免疫細(xì)胞

　　總的來說，這項(xiàng)研究成果揭示了HCC患者外周血TEM和APC與ICB治療應(yīng)答和irAEs都有重要關(guān)系，免疫應(yīng)答和irAEs反應(yīng)是由TEM和APC之間不同的TNF信號(hào)通路所促成的。因此，通過阻斷造成irAEs的TNFR2信號(hào)傳導(dǎo)可實(shí)現(xiàn)ICB副作用的消除，這對未來HCC患者的ICB療效早期檢測和聯(lián)合免疫療法的改進(jìn)都有重要的意義。

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