心肌梗死(myocardial infarction,MI)是患者冠狀動脈發(fā)生缺血缺氧所引起的心肌壞死，其發(fā)病迅速、病情兇險，?？晌＜吧Ｔ摷膊≡跉W美最常見，美國每年約有150萬人發(fā)生心肌梗死。中國近年來呈明顯上升趨勢，每年新發(fā)至少50萬。急性心肌梗死發(fā)生時心肌細胞的血氧不足，缺血心肌的多種炎癥因子被大量釋放，促進心室重構(gòu)，進而導(dǎo)致心臟肥大。這一過程中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin angiotension aldosterone, RAAS)的過度激活發(fā)揮了重要作用。血管緊張素Ⅱ通過刺激成纖維細胞，產(chǎn)生膠原蛋白，促進心肌細胞肥大和心肌纖維化，從而形成心臟瘢痕組織。雖然瘢痕形成可預(yù)防心肌梗死后心臟破裂，但瘢痕組織往往缺乏彈性，限制心臟的高效跳動能力，引起血流動力學(xué)功能障礙和心律失常，從而導(dǎo)致心力衰竭。臨床上已將心肌梗塞后瘢痕組織的大小作為心血管預(yù)后的獨立預(yù)測指標，疤痕組織尺寸越大的患者出現(xiàn)心率問題、心力衰竭和心臟猝死的風險就越大。因此，科學(xué)家一直致力于探究如何減少瘢痕組織的形成，恢復(fù)心肌梗死后梗死灶的功能。

　　肌成纖維細胞活化狀態(tài)與纖維化瘢痕的產(chǎn)生、成熟以及心肌重塑有關(guān)，而動態(tài)成纖維細胞向肌成纖維細胞狀態(tài)過渡是心臟纖維化反應(yīng)的基礎(chǔ)。近日，來美國華盛頓大學(xué)的Jennifer Davis團隊在Cell Stem Cell雜志在線發(fā)表了題為MBNL1 drives dynamic transitions between fibroblasts and myofibroblasts in cardiac wound healing的研究論文，揭示了在心臟創(chuàng)傷愈合過程中控制成纖維細胞狀態(tài)可塑性的分子開關(guān)MBNL1。作者發(fā)現(xiàn)，MI發(fā)生后，MBNL1的表達調(diào)控心臟成纖維細胞的增殖以及向肌成纖維細胞活化狀態(tài)的過渡和維持。該研究為研發(fā)治療心肌梗死的藥物提供了新思路和理論基礎(chǔ)。

　　肌成纖維細胞狀態(tài)是不穩(wěn)定并可逆的，而這些狀態(tài)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵控制點是轉(zhuǎn)錄組成熟，它主要由RNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)，如muscleblind-like 1(MBNL1)。MBNL1 通過穩(wěn)定、剪接、多腺苷酸化和定位其靶標 mRNA 來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄組。作者前期研究顯示，MBNL1缺失小鼠的心臟在損傷后肌成纖維細胞密度和纖維化瘢痕形成均有所下降。同時，在成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化過程中，血清反應(yīng)因子(serum response factor, SRF)和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin, can)等轉(zhuǎn)錄本是必需的，而它們受到MBNL1的調(diào)控。這些數(shù)據(jù)共同表明MBNL1在驅(qū)動心臟纖維化前期狀態(tài)和纖維化中發(fā)揮重要作用，但這尚未在體內(nèi)得到明確證明。因此，作者在本研究中對上述推論進行了深入探究。

　　首先作者在Postnlineage reporter mice(PostniCre-mT/mG，可以通過流式細胞儀分選不同狀態(tài)的成纖維細胞)中比較了靜息態(tài)成纖維細胞和心肌成纖維細胞的基因表達情況。與未標記的靜息態(tài)成纖維細胞相比，在MI發(fā)生后的所有時間點中，Postn-traced成纖維細胞中的一些經(jīng)典的肌成纖維細胞標志基因顯著上調(diào)，包括Col1a1和Acta2。隨后，作者檢測了Mbnl1的表達情況。結(jié)果顯示，與靜息態(tài)的成纖維細胞相比，Postn-traced肌成纖維細胞中的Mbnl1基因表達水平顯著升高。此外，作者還檢測了來自心衰心臟(富含肌成纖維細胞的一種組織來源)的成纖維細胞，Mbnl1和Acta2顯著上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明在人和小鼠中，MBNL1的活性與肌成纖維細胞的形成相關(guān)。

　　那么MBNL1是否可以將心臟成纖維細胞(cardiac fibroblasts)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞(myofibroblasts)呢?作者通過MBNL1條件性轉(zhuǎn)基因小鼠(MBNBL1 Tg-Tcf21iCre)，在心臟成纖維細胞中特異性地誘導(dǎo)過表達MBNL1。通過FACS(fluorescence-activated cell sorting)分選心臟成纖維細胞，隨后進行RNA-seq測序和分析，鑒定出了420個差異表達(differential expression, DE)基因(MBNBL1 Tg-Tcf21iCrevs. NTG-Tcf21iCre)。在沒有發(fā)生損傷時，MBNL1的過表達足以將心臟成纖維細胞轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞轉(zhuǎn)錄組。與NTGs對照相比，在未損傷的MBNL1 Tg-Tcf21iCre成纖維細胞中，肌成纖維細胞轉(zhuǎn)錄標記物(Acta2、Postn、Fn1、Lox和Col5a2)包含在前25個DE基因中。盡管MBNBL1過表達成纖維細胞具有促纖維化肌成纖維細胞轉(zhuǎn)錄組，但兩組小鼠的心肌纖維化程度、aSMA+肌成纖維細胞數(shù)量、心臟結(jié)構(gòu)和功能均無明顯差異，因此作者推測需要額外的刺激來實現(xiàn)生理肌成纖維細胞表型。

　　為了展示出纖維化表型，作者對MBNL1 Tg-Tcf21iCre和NTG小鼠進行了MI處理。與來源于NTG小鼠的心臟成纖維細胞相比，MI顯著地上調(diào)了MBNL1 Tg-Tcf21iCre小鼠(簡稱“Tg小鼠”)中的多個膠原基因(包括Col1a1,Col1a2,Col3a1,Col5a1和Col5a2)。與NTG小鼠相比，Tg小鼠心臟邊界區(qū)的膠原纖維變短，縮短分數(shù)(fractional shortening)降低10%，并呈現(xiàn)出微弱的心室擴張。有研究表明衰老MBNL1 Tg-Tcf21iCre小鼠在無損傷情況下促進間質(zhì)纖維化，因此，作者先對MBNL1 Tg-Tcf21iCre和NTG小鼠進行MI處理，待梗死瘢痕完全形成時(約3個月)再進行檢測。雖然兩種小鼠中的纖維化瘢痕形成面積、肌成纖維細胞密度和心肌重構(gòu)依舊沒有明顯差異，但Tg小鼠中的瘢痕組織更成熟，這種增強的疤痕成熟與基質(zhì)成熟因子(如Lox和Runx1)的表達增加一致，說明MBNL1可以增加瘢痕組織的穩(wěn)定性。過表達的MBNL1可能通過兩種方式限制肌成纖維細胞數(shù)量：誘導(dǎo)凋亡或抑制傷口愈合的增殖階段。TUNEL染色顯示兩組小鼠中的成纖維細胞凋亡并沒有明顯區(qū)別，而細胞增殖檢測發(fā)現(xiàn)，Tg小鼠的心臟成纖維細胞的增殖與NTGs相比降低了20%左右，說明MBNL1會抑制MI誘導(dǎo)的心臟成纖維細胞的增殖。

　　隨后，作者在小鼠心臟成纖維細胞中特異性地敲除了MBNL1(MBNL1Fl/Fl-Tcf21iCre小鼠，簡稱為Fl-Tcf21iCre)，用于檢測MBNL1在心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)化中的作用。在正常狀態(tài)下，心臟成纖維細胞特異性MBNL1缺失并不影響心臟功能，但在MI發(fā)生后，對照組小鼠(MBNLFl/Fl)會出現(xiàn)心室擴張的表型，而Fl-Tcf21iCre小鼠不會發(fā)生心室擴張。同時，F(xiàn)l-Tcf21iCre小鼠中的纖維化和肌成纖維細胞密度比對照組減少了40%左右，說明在肌成纖維細胞的形成和纖維化過程中MBNL1是必要的。作者還發(fā)現(xiàn)Fl-Tcf21iCre心臟的膠原纖維寬度和排列也降低了，說明敲除MBNL1會阻礙瘢痕組織的成熟和穩(wěn)定。MBNL1Fl/Fl和Fl-Tcf21iCre小鼠進行MI處理后，用EdU標記增值細胞，作者發(fā)現(xiàn)在Fl-Tcf21iCre小鼠心臟中，增殖細胞約占45%，對照組約為31%。由于增殖加強通常與去分化有關(guān)，因此作者進行了心臟成纖維細胞轉(zhuǎn)錄組分析，進而探究敲除MBNL1是否可以促進損傷響應(yīng)中的去分化。與MBNL1Fl/Fl組相比，F(xiàn)l-Tcf21iCre成纖維細胞中的一些心臟成纖維細胞特異性轉(zhuǎn)錄本顯著降低。同時，已有研究顯示，EMT(epicardial to mesenchymal transition, 心外膜向間充質(zhì)過渡)的其他驅(qū)動因素，如Zeb1和Slug以及心外膜發(fā)育基因Aldh1a2,Aldh1a1和Tbx18，也在Fl-Tcf21iCre心臟成纖維細胞中上調(diào)，表明MBNL1缺失的心臟成纖維細胞比野生型更具可塑性。

　　EMT調(diào)節(jié)基因表達的改變并不能最終確定這些信號是否與MBNL1在成纖維細胞命運或心外膜的重新激活有關(guān)，因此，作者進行了單細胞測序?qū)嶒?single cell RNA-seq, scRNA-seq)。他們期望在MBNL1細胞群中出現(xiàn)一種獨特的具有心外膜祖細胞特征或擴張?zhí)卣鞯某衫w維細胞亞狀態(tài)。出人意料的是，F(xiàn)l-Tcf21iCre心臟成纖維細胞群中心外膜和心外膜/間皮細胞簇完全不存在，而這些心外膜細胞群在NTGs中擴大，作者認為這是心肌梗死后第1至5天內(nèi)發(fā)生的正常心外膜重新激活和擴大。隨后，通過聯(lián)合分析scRNA-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)，作者對MBNL1-Tg和MBNL1-null心臟成纖維細胞進行了比較，發(fā)現(xiàn)MBNL1功能的獲得和喪失導(dǎo)致了完全相反的命運決定，證明MBNL1作為轉(zhuǎn)錄后開關(guān)調(diào)控成纖維細胞和肌成纖維細胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。

　　最后，作者對MBNL1如何驅(qū)動MI后心臟成纖維細胞狀態(tài)發(fā)生改變進行了探索。作者根據(jù)以下3個標準進行了數(shù)據(jù)挖掘: MBNL1結(jié)合因子，肌成纖維細胞分化的誘導(dǎo)因子和MI后的Fl-Tcf21iCre心臟成纖維細胞中下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子。最終篩選了唯一能夠同時滿足這3個標準的基因Sox9(一種對 EMT 和肌成纖維細胞形成至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子)。與損傷后的靜息態(tài)成纖維細胞相比，損傷后的肌成纖維細胞中的Sox9表達上調(diào)了8.5倍;相反，Sox9陽性的成纖維細胞的百分比在心肌梗死Fl-Tcf21iCre心臟中下調(diào)了2.5倍。在MBNL1Fl/Fl和Fl-Tcf21iCre心臟成纖維細胞中轉(zhuǎn)染Sox9足以誘導(dǎo)aSMA陽性肌成纖維細胞，說明Sox9可以獨自促進肌成纖維化狀態(tài)，進而在MBNL1-null成纖維細胞中拯救分化缺陷。那么MBNL1是否可以穩(wěn)定Sox9轉(zhuǎn)錄本?作者在MBNL1Fl/Fl和Fl-Tcf21iCre心臟成纖維細胞中進行了mRNA衰減實驗。結(jié)果顯示，F(xiàn)l-Tcf21iCre成纖維細胞中Sox9的表達比BNL1Fl/Fl對照組中的少53%，說明Fl-Tcf21iCre心臟成纖維細胞中的轉(zhuǎn)錄本衰減更快。在MBNL1Fl/Fl和Fl-Tcf21iCre心臟成纖維細胞中表達MBNL1均可以上調(diào)Sox9的表達水平。這些數(shù)據(jù)表明，心肌梗死后，MBNL1通過穩(wěn)定心肌成纖維細胞中的Sox9轉(zhuǎn)錄本，進而促進肌成纖維細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變。

　　總的來說，該研究顯示MBNL1通過調(diào)節(jié)損傷誘導(dǎo)的成纖維細胞狀態(tài)動態(tài)，進而調(diào)控不良的心肌重構(gòu)和纖維化瘢痕的性質(zhì)?？刂萍〕衫w維細胞可逆性的能力為解決纖維化的臨床負擔帶來了很大的希望，因為通過藥物或遺傳手段防止肌成纖維細胞活性的誘導(dǎo)和維持可以顯著防止心臟和其他組織的纖維化重塑。靶向成纖維細胞可塑性背后的轉(zhuǎn)錄后機制是一種很有前景的方法，因為大約1/3的基因表達變化受轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的影響。作者認為MBNL1具有良好的治療性能，因為它調(diào)節(jié)心臟創(chuàng)傷愈合和修復(fù)所需的成纖維細胞功能的多個層面，但依舊還需要更多的研究來了解MBNL1在其他模型(如慢性應(yīng)激)中調(diào)節(jié)細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的作用。同時，作者認為在Sox9機制方面還缺乏體內(nèi)證據(jù)來證實Sox9可以拯救心臟的纖維化反應(yīng)，這一信息將有助于更好地理解RNA結(jié)合蛋白在控制心肌纖維化中的治療潛力。

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