如果能夠建立識(shí)別單個(gè)蛋白質(zhì)中單氨基酸分辨率的工具對于細(xì)胞生物學(xué)的研究將有巨大的推動(dòng)作用。但目前能做得到的是對基因序列進(jìn)行測序，但是無論是DNA基因組還是RNA轉(zhuǎn)錄組都不能帶給我們對于蛋白質(zhì)的全面認(rèn)識(shí)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中還包含翻譯后修飾以及剪接相關(guān)的信息。因此，在單分子水平上能夠直接將蛋白質(zhì)測序并檢測翻譯后修飾的穩(wěn)健方法將極大地有利于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，促進(jìn)對于低豐度蛋白以及翻譯后修飾分布的檢測。為此，荷蘭代爾夫特理工大學(xué)研究組在發(fā)文題為，Multiple rereads of single proteins at single-amino acid resolution using nanopores，提供了一種基于納米空測序的單分子蛋白閱讀器，可以以高保真度和高通量區(qū)分單個(gè)蛋白質(zhì)在單一氨基酸分辨率下的信息。
納米孔測序是一種單分子DNA測序技術(shù)，該技術(shù)能夠在便攜式平臺(tái)上以最小的成本長時(shí)間讀取和檢測表觀遺傳標(biāo)記，最早起源于上世界80年代的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室。在納米孔測序中，納米孔作為生物傳感器提供了唯一的通道，使兩種不同的離子溶液被電壓為基礎(chǔ)的膜給隔開，形成順式一側(cè)和反式一側(cè)。分子通過納米孔的時(shí)候在順反兩側(cè)產(chǎn)生離子電流，通過聚合酶或者解旋酶與多核苷酸緊密結(jié)合，逐步控制核苷酸通過納米孔，不同堿基產(chǎn)生不同的電流，從而讀出核苷酸序列。因此，納米孔最窄的孔徑區(qū)域就是其傳感區(qū)域，通過納米孔和沿著核苷酸行走的解旋酶，促使DNA以一個(gè)一個(gè)堿基的方式通過納米孔。
圖1 納米孔技術(shù)
有人曾經(jīng)提出假設(shè)，可以利用納米孔技術(shù)對蛋白質(zhì)也進(jìn)行單個(gè)氨基酸的測序，研究表明小肽片段通過納米孔自由轉(zhuǎn)運(yùn)的方式可以對單個(gè)氨基酸表現(xiàn)出敏感性，但是目前尚缺乏地確定氨基酸順序以及重建蛋白質(zhì)序列的方法。為此，作者們。該鏈由一條80個(gè)核苷酸的DNA鏈組成，通過疊氮化合物修飾共價(jià)鏈接一個(gè)26氨基酸的合成肽，該肽段中富含帶負(fù)電的氨基酸比如天冬氨酸和谷氨酸，這樣通過電滲力將多肽拉過納米孔。納米孔使用的突變型的MspA，具有杯子的形狀，可以將解旋酶從離子電流阻塞的孔收縮過程中分離出約10 nm。對于DNA易位動(dòng)力蛋白酶，作者們使用的是Hel308 DNA解旋酶。使用該解旋酶是因?yàn)橥ㄟ^MspA拉動(dòng)DNA單鏈每次的長度是0.33nm，剛好是單個(gè)氨基酸的步長，另外該解旋酶比較穩(wěn)定且能夠耐受高鹽，而且其拉力大于50pN可以解開任何的靶標(biāo)多肽的二級結(jié)構(gòu)。
圖2 通過納米孔閱讀單肽
作者們發(fā)現(xiàn)，類似于DNA序列的納米孔讀取，通過納米孔的多肽會(huì)在離子流中產(chǎn)生一個(gè)獨(dú)特的階梯狀模式。每次讀取時(shí)離子電流步驟的持續(xù)時(shí)間各不相同，但水平序列信號(hào)特征具有高度的可重復(fù)性。通過建立識(shí)別軟件，作者們可以準(zhǔn)確識(shí)別電流信號(hào)，并對電流中值進(jìn)行分析，從而回溯確認(rèn)序列的信息。
圖3 DNA-肽結(jié)合體通過納米孔以及電流讀數(shù)
進(jìn)一步地，作者們想對該系統(tǒng)的精確性進(jìn)行分析，因此作者們構(gòu)建了不同的DNA-肽結(jié)合體，但是每個(gè)結(jié)合體中只改變某一個(gè)氨基酸，從而可以確認(rèn)在單氨基酸改變的情況下該系統(tǒng)是否能夠識(shí)別出不同。作者們發(fā)現(xiàn)電流信號(hào)在多個(gè)水平上具有差異，表明即使是單一氨基酸的替換也可以被該系統(tǒng)區(qū)分出來。為了定量評估對于多肽變異的可區(qū)分性，作者們進(jìn)行了混淆矩陣的計(jì)算，發(fā)現(xiàn)可以以87%的平均準(zhǔn)確率識(shí)別氨基酸變體。作者們發(fā)現(xiàn)通過連續(xù)控制解旋酶對同一分子進(jìn)行多次獨(dú)立的重新讀取，可以消除導(dǎo)致納米孔讀取不準(zhǔn)確的隨機(jī)錯(cuò)誤，從而大幅度提高納米孔蛋白讀取器的識(shí)別保真度。
但作者們對該方法的局限性也進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)納米孔可以能夠順利轉(zhuǎn)運(yùn)帶有中性極性、非極性以及正電極性的氨基酸多肽，但是高正電荷的多肽易位轉(zhuǎn)運(yùn)的效率很有限。但幸運(yùn)的是，通過對人類蛋白質(zhì)組的分析顯示，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)序列比帶正電荷的蛋白質(zhì)序列更常見。
總的來說，該工作建立了能夠以單氨基酸精度進(jìn)行多肽測序的方法，不需要對設(shè)備進(jìn)行重新的設(shè)計(jì)只需要改變樣品制備和對電流信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的軟件即可達(dá)到目標(biāo)。該工具仍然保留了納米孔進(jìn)行DNA測序的特點(diǎn)，低成本、且對單個(gè)分子的微小物理變化非常敏感。該工作向著低成本蛋白質(zhì)測序的邁出了新的一步，能夠?qū)崿F(xiàn)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究，為基礎(chǔ)生物學(xué)和臨床中的應(yīng)用提供了新的思路。
原文鏈接：
https://www.science.org/doi/10.1126/science.abl4381
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