蛋白翻譯中的缺陷導致蛋白質(zhì)表達的變化，這些變化可能會成為癌癥形成的驅(qū)動因素。NAD+是一種重要的代謝產(chǎn)物，通過作為氧化還原反應的輔助因子以及多聚核糖基化轉(zhuǎn)移酶(poly(ADP-ribosyl)，PARPs)和sirtuins乙酰化酶等的底物來調(diào)節(jié)多種細胞途徑。NAD+的合成的和功能在細胞中具有區(qū)室化的特征，但是NAD+區(qū)室化以及其在癌癥中的功能意義尚不清楚。
近日，美國德克薩斯西南醫(yī)學中心W. Lee Kraus研究組發(fā)文題為Ribosome ADP-ribosylation inhibits translation and maintains proteostasis in cancers，發(fā)現(xiàn)在癌癥細胞中核糖體單ADP -核糖基化的修飾會通過影響翻譯過程并維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定，為卵巢腫瘤等提供了新的治療靶點。
在氧化還原反應中，NAD+被轉(zhuǎn)化為還原形式的NADH。但是PARPs是通過切割ADP- ribose的部分并將其共價連接到特定底物蛋白質(zhì)中的氨基酸來消耗NAD+。PARPs是細胞內(nèi)NAD+的主要消耗者，其活性依賴于細胞對NAD+的補充能力。NAD+可以由ADP核糖基化反應的副產(chǎn)物煙酰胺通過回收途徑重新合成。該途徑中最后一步是由煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(Nicotinamide mononucleotide adenylyl transferases，NMNATs)，不同的NMNATs具有特殊的亞細胞定位、不同的水平與功能。其中NMNAT-1定位在細胞核里;NMNAT-2定位在高爾基體，并在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用;而NMNAT-3根據(jù)不同的細胞種類而定位在線粒體或者細胞質(zhì)之中。到目前為止，大多數(shù)研究都集中在了解主要由核PARP-1和PARP-2介導的多聚ADP-核糖基化修飾PARylation(簡稱PAR修飾)的生物學重要性，但對單核ADP-核糖基化修飾MARylation(簡稱MAR修飾)和催化這些反應的酶的生物學重要性知之甚少。因此，作者們希望揭開單ADP-核糖基化以及NAD+穩(wěn)態(tài)調(diào)控在癌癥生物學中的作用。
作者們發(fā)現(xiàn)在卵巢腫瘤中NMNATs具有非常獨特的表達模式：與良性的卵巢組織相比卵巢腫瘤中NMNAT2的mRNA水平上調(diào)而NMNAT3的mRNA水平下調(diào)。為了檢測NMNAT2敲低后對于NAD+的影響，作者們使用了遺傳編碼的NAD+的sensor對進行檢驗，發(fā)現(xiàn)NMNAT2敲低后會顯著減低胞質(zhì)中的NAD+但是提高細胞核中的NAD+。這些結果說明NMNAT-2對于卵巢腫瘤中細胞中的NAD+的胞質(zhì)定位合成以及穩(wěn)態(tài)非常關鍵。
NMNAT-2調(diào)節(jié)胞質(zhì)中的NAD+的水平，因此作者們認為NMNAT-2可能對于卵巢腫瘤細胞胞質(zhì)中的PARPs/MARTs的活性具有一定的支持作用。通過免疫熒光檢測，作者們發(fā)現(xiàn)MAR最初定位在細胞質(zhì)中，而PAR定位在細胞核中。而在NMNAT-2敲低后會顯著降低胞質(zhì)中的MAR水平但是不會影響到PAR水平。因此，這些結果說明NMNAT-2合成的NAD+會影響到卵巢腫瘤細胞中的MAR修飾。進一步地，作者們通過卵巢腫瘤病人的樣本確認NMNAT-2與MAR水平之間存在顯著的正相關，并且高水平的MAR修飾水平會導致無進展生存預后差。通過對核糖體蛋白修飾的檢測，作者們發(fā)現(xiàn)其中大部分的蛋白均是被MAR修飾而非PAR修飾。同時，通過對NMNAT-2酶活性的破壞，作者們確認NMNAT-2酶活性對于核糖體蛋白的MAR修飾是非常關鍵的。
為了檢測NMNAT-2對核糖體蛋白MAR修飾的調(diào)節(jié)作用對mRNA的翻譯的影響，作者們使用嘌呤霉素攝取實驗來測量卵巢腫瘤細胞中蛋白合成的水平。作者們發(fā)現(xiàn)對核糖體蛋白進行MAR修飾的NMNAT-2會通過以酶催化活性依賴的方式抑制蛋白合成。通過siRNA篩選鑒定，作者們發(fā)現(xiàn)涉及其中的PART-16是唯一影響核糖體蛋白MAR修飾的MART。PARP-16是一種尾部錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的駐留蛋白，通過修改通路中的關鍵酶調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。通過生化實驗檢測，作者們發(fā)現(xiàn)NMNAT-2與PARP-16在細胞中存在相互作用，但是該相互作用并不依賴于NMNAT-2的酶活性，NMNAT-2酶活性會影響PARP-16上的MAR修飾。因此，作者們的工作建立起了NMNAT-2與PARP-16之間通過NAD+產(chǎn)生的直接聯(lián)系。
癌細胞需要高水平的蛋白質(zhì)合成來支持它們的合成代謝過程，但高水平的蛋白質(zhì)合成可能導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，并導致有毒蛋白質(zhì)聚集物的形成。考慮到PARP-16調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，作者們對NMNAT-2與PARP-16敲除之后的蛋白質(zhì)凝聚體的形成進行檢測，發(fā)現(xiàn)通過敲除后會降低核糖體蛋白的MAR修飾并且會促進蛋白合成以及蛋白凝聚體的形成。 那么核糖體蛋白的MAR修飾是如何影響核糖功能以及抑制蛋白合成的呢?作者進行了多核糖體譜(Polysome profiling)的實驗并在NMNAT-2或者PARP-16敲除后進行了多核糖體的RNA-seq檢測，發(fā)現(xiàn)核糖體的承載量在敲除后出現(xiàn)了顯著的增加。先前的研究的表明mRNA的非翻譯區(qū)存在調(diào)控元件可以調(diào)節(jié)mRNA的翻譯【5】。為此作者們對核糖體裝載發(fā)生變化的mRNA進行分析后發(fā)現(xiàn)，這些mRNA的二級結構中包含莖環(huán)結構，正是這樣的莖環(huán)結構的存在導致mRNA上核糖體的裝載從而在NMNAT-2或者PARP-16敲除的情況下影響蛋白合成。
進一步地，通過在輸卵管上皮細胞中進行異常的NMNAT-2過表達。作者們發(fā)現(xiàn)NMNAT-2過表達會提高蛋白的合成。另外，作者們對核糖體上MAR修飾的位點進行了鑒定。這些位點上MAR修飾的缺失會因為促進多核糖體的組裝而促進蛋白質(zhì)的合成。
總得來說，該工作整合了細胞代謝、核糖體功能以及蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的具體分子途徑，將NMNAT-2介導的胞質(zhì)NAD+合成和PARP-16介導的胞質(zhì)蛋白MAR修飾連接起來。核糖體MAR修飾通過調(diào)制蛋白質(zhì)合成水平以及防止有毒蛋白質(zhì)聚集，促進了癌癥中的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，這一機制的研究為卵巢腫瘤的研究和治療提供了新的可能靶點。
原文鏈接： https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.07.005
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